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原标题:洛克菲勒大学利用CRISPR-Cas13介导的细菌抵御噬菌

浏览次数:77 时间:2019-11-26

中科院南海海洋所等:细菌用病毒分“敌我”

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本报讯传统意义上,病毒被认为是细菌的“敌人”。但定植在肠道中的细菌却可以通过病毒进行“自我识别”,即区分自己和其他细菌。近日,中国科学院南海海洋研究所王晓雪课题组和美国合作者在《细胞—报告》报道了细菌利用感染它们的病毒进行自我识别的新方式。这为细胞利用病毒将自己与近源竞争对手区分开来提供了第一个证据。

2019年5月30日,来自纽约洛克菲勒大学细菌学实验室的LucianoA. Marraffini团队在Nature杂志发表文章——Cas13-induced cellular dormancy prevents the rise of CRISPR-resistant bacteriophage,文章鉴定了Cas13介导的非特异性剪切RNA的能力能够剪切宿主和噬菌体表达的RNA,赋予宿主防御DNA病毒感染和抗CRISPR病毒感染的能力。

文章联合通讯作者、宾夕法尼亚州立大学教授Thomas Wood指出:“这意味着我们应该重新评估病毒与其细胞宿主之间的关系,因为有时病毒感染也可能是件‘好事’。”

细菌的CRISPR基因座是指被来源于噬菌体和质粒的短片段分隔开的30-40bp间隔重复的序列,它和功能与核酸加工相关的CRISPR相关蛋白共同组成细菌的免疫系统。CRISPR基因座可转录出并加工为short CRISPR RNAs ,介导Cas核酸酶靶向并破坏入侵噬菌体或质粒的互补序列,发挥免疫作用。根据效应核酸酶组成的亚基数量,CRISPR-Cas系统可以分为两类:第一类系统的核酸酶由多个亚基组成,根据crRNA加工复合体和核酸酶的组分是否存在交互,可进一步再分为Ⅰ,Ⅲ和Ⅳ型;第二类系统的核酸酶由单一的,多功能的蛋白组成,并根据核酸酶的结构分为Ⅱ,Ⅴ,Ⅵ型。其中,Ⅵ型系统的核酸酶Cas13是一种依赖于RNA靶向的RNA核酸酶,在分子诊断方面具有重要的应用价值。

王晓雪团队在准备细菌运动性平板时,发现不同的大肠杆菌K-12菌株之间在运动性平板上形成了分界线,而相同的克隆株之间并不会形成这种分界线。为揭示背后的机制,研究人员对完整大肠杆菌K-12中4296个单基因敲除的菌株进行了筛选。结果发现,当菌株中携带的突变基因影响到噬菌体复制所需的基因时,分界就完全消失了。

Cas13被报道既具有切割与crRNA互补的RNA间隔序列前体能力,还具有一种特殊的性质:它可以非特异性地剪切附带RNA,并且这一过程依赖于Cas13切割间隔序列前体的发生。但这一特性的生理意义目前未知。另一方面,通过分析表达Cas13的原核生物的spacer序列,发现其既靶向RNA病毒,又含有靶向双链DNA病毒的序列,说明Cas13在防御DNA病毒的过程中也起到重要作用,但如何发挥功能并不清楚。而这与Cas13的非特异剪切RNA的能力是否相关一直是研究者们关心的问题。

研究人员还发现,一个古老的隐匿型噬菌体CPS-53携带的YfdM蛋白,是负责细菌自我识别的关键蛋白。他们建议重新评估病毒与其他细胞宿主之间的关系,因为病毒感染可能在某些竞争条件下对宿主有利。

为研究Cas13的功能,作者首先在type VI-A CRISPR–Cas系统的天然宿主Listeria ivanovii中构建了Cas13介导的Listeriaivanovii ΩCRISPRVI抵御φRR4DNA噬菌体感染的模型。通过构建靶向φRR4全基因组的spacer文库,最终筛选到能够有效防御的三条spacer序列:靶向anti-CRISPR区域的spcA,靶向早期裂解基因的spcE和靶向晚期裂解基因的spcL。表达三条spacer序列能够有效降低病毒的感染中心效率和裂解量,说明Cas13能够介导宿主抵御DNA噬菌体的感染。

相关论文信息:DOI:

图1:Cas13a阻碍了DNA病毒感染。

《中国科学报》 (2019-04-22 第4版 综合)

鉴于三条spacer序列靶向的序列既包括病毒必需基因,也包括非必需基因,作者认为Cas13的非特异RNA剪切功能发挥了重要作用。因此,作者使用RNA-seq和RNA5’端鉴定的方法分析了噬菌体和宿主的转录产物以鉴定Cas13非特异RNA剪切功能的靶标。结果发现,噬菌体和宿主的转录产物都发生了普遍的断裂。没有观察到晚期裂解基因的表达可能是由于早期基因mRNA被剪切导致功能丧失进而无法激活晚期基因的表达。以上结果表明,Cas13可以广泛地剪切噬菌体和宿主的转录本mRNA。

图2:Cas13广泛剪切噬菌体和宿主的转录本。

作者发现,Cas13的激活显著抑制宿主的生长,但并不会导致宿主的死亡。并且,Cas13激活会导致宿主对抗生素的耐受,进一步证明Cas13激活导致宿主进入休眠状态。同时,将表达spcE的菌株与感染敏感菌株共培养,可以显著保护敏感菌株,说明Cas13限制噬菌体的增殖进而保护未感染的细胞群体。而使用外源质粒激活CRISPR-Cas13系统,也会保护宿主防御噬菌体的感染,这表明Cas13激活引起的休眠效应足以发挥对噬菌体感染的抵抗作用。以上实验说明,Cas13激活诱导宿主进入休眠状态,从而防御DNA噬菌体的感染。

图3:Cas13诱导宿主休眠进而抑制噬菌体增殖。

根据Cas13广泛的保护作用,作者猜测即使噬菌体群体中的部分个体发生自然突变,导致crRNA不能与靶向RNA配对,Cas13也能有效地中和这部分噬菌体。为验证此推测,作者构建不与spcA配对的φRR4acr和不与spcE配对的φRR4early两株突变噬菌体,并将其与野生型噬菌体按照1:105混合后感染细菌,发现Cas13能够有效的清除噬菌体,而单独感染突变噬菌体则不能发挥保护作用。混合另一株肌尾噬菌体A511也得到了类似的结果。相比Cas13,Cas9不具有类似的保护效应。

图4:Cas13激活抵御非靶标的噬菌体感染。

综上,作者鉴定了Cas13非特异剪切RNA的功能在宿主遭遇DNA病毒和突变破坏crRNA识别的病毒感染时发挥保护作用的机制:激活的Cas13非特异剪切宿主和噬菌体的转录本,减少噬菌体表达和宿主体内的病毒DNA复制必须因子,阻断病毒复制;同时诱导宿主进入休眠状态,进一步阻断噬菌体侵染未被感染的细菌。

关于噬菌体

噬菌体是侵袭细菌的病毒,也是赋予宿主菌生物学性状的遗传物质。噬菌体是病毒中最为普遍和分布最广的群体。通常在一些充满细菌群落的地方,如:泥土、动物的肠道里,都可以找到噬菌体。

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